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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2021年9月9日

*编辑：俞纪元

细菌耐药性的出现与扩散威胁着全球公共卫生安全。据2014年统计，细菌耐药性每年导致70万人左右的死亡。若不采取有效措施，预计至2050年每年可能激增至1000万人，并且治疗细菌感染的全球经济产出累计损失将达到100万亿美元。可见，细菌感染形势严峻， 且不容乐观。不幸的是，医药监管机构批准的新型抗生素种类和数量却在一直减少。因此，为有效应对细菌耐药性问题，亟需开发新型抗菌药物和抗菌疗法。

纳米酶可以通过原位自发产生活性氧（ROS），通过氧化对细菌正常功能至关重要的各种物质（如核酸、蛋白质和脂质）导致细菌死亡，被认为是具有广阔应用前景的新型抗菌剂。然而ROS无法区分细菌和哺乳动物细胞，因此，纳米酶失去了理想抗菌剂所必备的选择性。就另一方面而言，由于ROS的寿命很短并且有效作用半径有限，细菌在其细胞壁完好无损的情况下不能吞噬胞外的纳米颗粒（如4 nm 左右的金纳米颗粒），而哺乳动物细胞容易通过内吞作用内化纳米粒子，进而将粒子捕获到囊泡内。内化的粒子可以大量存在于细胞质中，并且其破坏并不一定导致细胞死亡。可见，若纳米酶产生的是表面吸附态ROS，则可能会优先杀死细菌而不是哺乳动物细胞。

基于此，中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家研究中心、化学与材料科学学院的阳丽华课题组与熊宇杰团队合作，提出了构建高效低毒抗菌纳米酶的新策略。由于金属和合金纳米酶的类氧化酶可以催化产生金属表面吸附态ROS，并且与纯金属相比，合金具有更对称的独特吸附位点，因此可能具有很高的反应活性并允许更灵活的设计。如图1a所示，作者通过以银纳米笼（AgNC）为模板，设计了一系列银钯合金（AgPd）纳米笼，并从中筛选出能高效原位催化生成表面吸附态ROS的AgPd0.38纳米笼作为模型纳米酶。为了验证AgPd0.38可以原位催化生成表面吸附态ROS，作者利用二氢卟吩e6/聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Ce6/PLGA）在光照条件下可以产生游离ROS，并且脂质双分子层（lipid）不会影响游离ROS自由通过的特征设计实验。结果显示，与Ce6/PLGA相比，lipid包覆的Ce6/PLGA（Ce6/PLGA@lipid）产生的ROS荧光探针未有显著变化（图1f、g、h、i），而与AgPd0.38相比，lipid包覆的AgPd0.38（AgPd0.38@lipid）的ROS荧光信号却显著下降（图1j、k、l、m）。因此，AgPd0.38通过类氧化物酶活性原位生成表面吸附态ROS。

图2 AgPd0.38可以优先杀死细菌而保护正常哺乳动物细胞。

那么AgPd0.38是如何获得优先杀死细菌的能力而不伤害正常哺乳动物细胞的？与细菌相比，哺乳动物细胞可以通过内吞作用将纳米颗粒内化，内吞作用通过微胞饮、网格蛋白依赖性内吞和小泡依赖性内吞等多种途径发生（图3d）。若使用一些内吞抑制剂，如阿米洛利、蔗糖和甲基-β-环糊精等则会降低细胞对AgPd0.38的摄取率（图3e）。与对照组相比，加入抑制剂的AgPd0.38可以使细胞活力下降约35%（图3f），说明AgPd0.38的表面吸附态ROS可能具有一定的细胞毒性。为了研究内化后纳米颗粒的细胞毒性，作者用血小板膜包覆的AgPd0.38（AgPd0.38@P）来增加细胞摄取率，研究结果表明，与AgPd0.38相比，虽然 AgPd0.38@P被4T1细胞摄取率增加了5倍（图3h），AgPd0.38@P仍然几乎不影响细胞活力（图3i）。因此，抑制哺乳动物细胞对AgPd0.38的摄取才能使其具有细胞毒性，并且内吞作用出乎意料地保护了哺乳动物细胞免受AgPd0.38的影响。由于lipid不会影响游离ROS的自由通过，作者通过抗菌实验进一步证明AgPd0.38的表面吸附态ROS对细菌的选择性高于哺乳动物细胞。研究结果表明，AgPd0.38@lipid对各类细菌的MBC99.9是AgPd0.38的4倍（图3l），而Ce6/PLGA与Ce6/PLGA@lipid的抗菌活性相当，且两者对细胞的毒性也成浓度依赖关系（图3m、n）。可见，AgPd0.38通过表面吸附态ROS实现选择性抗菌作用。

图3 哺乳动物细胞的内吞作用意外发挥了“解毒”作用，使得AgPd0.38表面吸附态ROS具有选择性抗菌作用。

尽管临床上医疗器械（如导尿管、隐形眼镜等）已被广泛使用，它们还是经常会被细菌污染，甚至会形成结构致密的生物膜，这些生物膜可以保护病原菌免受宿主免疫反应和抗生素的攻击，从而导致生物医学植入器件失效。为了测试在体内复杂病理条件下AgPd0.38涂层是否可以有效抑制生物膜的形成，作者使用医疗导管作为模式医疗植入器件，并将AgPd0.38纳米笼作为表面涂层修饰添加剂。涂覆于本身没有抗菌能力的导管表面后形成复合导管（Ca/PDA/AgPd）（图4a、b），从而评估其对铜绿假单胞菌感染小鼠创面模型的治疗效果（图4c）。由于铜绿假单胞菌在形成生物膜时可以产生强烈的绿色荧光信号，与未涂覆AgPd0.38纳米笼的导管相比，Ca/PDA/AgPd处理之后的伤口处绿色荧光信号显著下降（图4e），面积显著缩小（图4f），并且与感染炎症相关的白细胞（WBC）（图4g）、中性粒细胞数目显著减少（图4h），同时细菌数量也最少（图4i）。这些结果表明，AgPd0.38作为一种有效的涂层添加剂，不仅可以在体内复杂的病理条件下抑制生物膜的形成，而且可以降低宿主感染相关的炎性反应。

图4 在铜绿假单胞菌感染小鼠伤口模型中，AgPd0.38作为涂层修饰添加剂可以使本身没有抗菌能力的导管获得抑制生物膜形成的能力，有助于降低小鼠感染相关的炎性反应。

总之，这篇文章证实了利用纳米酶产生的表面吸附态ROS进行选择性杀死细菌而保护正常哺乳动物细胞的可行性。这种选择性归因于其生成表面吸附态ROS和细胞内吞的“解毒”作用，这项工作为生物相容性纳米酶的研发开辟了道路，也为对抗耐药细菌的基因编码提供了可能。

参考文献：

Gao, F., Shao, T., Yu, Y., Xiong, Y. & Yang, L. Surface-bound reactive oxygen species generating nanozymes for selective antibacterial action. Nat Commun 12, 745, doi:10.1038/s41467-021-20965-3 (2021).

撰稿：魏艮

校审：程超群

编辑：周逸夫