溶菌酶（lysozyme，EC3.2.1.17）是一种天然无毒、安全绿色的抑菌剂，在机体的抗菌防御机制中起到重要作用，又称为胞壁质酶。

主要用于水产品、乳制品、果蔬、肉类及酒饮制品的防腐保鲜，延长食品货架期。鸡蛋清中溶菌酶含量约为3.5%，因为提取容易，可行性高，所以鸡蛋清溶菌酶研究最广泛且已投入工业化生产。

溶菌酶的抑菌机制主要作用于细菌细胞壁上的肽聚糖，通过水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4-糖苷键使肽聚糖裂解，从而起到抑菌的作用。

抑菌型包装体系一般由良好成膜性能的聚合物和抑菌物质共同组成。溶菌酶在食品包装中的应用可以通过固定化酶技术实现，经包埋或者吸附的方式负载在抑菌型包装膜基质上。

为了发展绿色无污染的食品包装产业，目前常用的可降解聚合物包括壳聚糖、海藻酸钠和淀粉等。

壳聚糖由于具有良好的成膜性和生物可降解性能，并且容易获得，是一种广受关注的食品包装材料。另一方面，壳聚糖本身具有抑菌性，而且壳聚糖膜拥有良好的气体阻隔性，可以有效的提高食品的货架期，改善食品品质。

由于壳聚糖亲水性较强，在潮湿环境中容易溶胀，导致其力学性能急剧下降，壳聚糖膜的实际使用受到了很大的限制。

因此，改善壳聚糖的力学性能和耐水性能对于抑菌型壳聚糖膜的实际应用至关重要。

目前，通过无机纳米材料与有机聚合物杂化是一种有效的提高复合膜性能的方法，既能保持有机物聚合物的韧性和安全性，又兼具有无机物的刚性和稳定性。

大量研究发现，纳米材料可以提高有机聚合物的机械性能、热稳定性和耐水性能，例如纳米二氧化硅、纳米氧化镁、纳米二氧化钛和碳纳米管等。

同时一些纳米材料本身具有一定的抗菌活性，能够加强聚合物薄膜对食品的保鲜能力。

本文研究选择纳米二氧化硅作为无机材料，将其以不同的质量比加入到壳聚糖膜中，探究纳米二氧硅对壳聚糖膜的力学性能、热稳定性和溶胀行为的影响，得出对壳聚糖膜改善效果最佳的二氧化硅添加量，并通过流变、低场核磁、红外光谱和XRD等分析方式探究纳米二氧化硅改善壳聚糖膜性能的机理。

随后以最佳的壳聚糖/纳米二氧化硅复合膜作为基质，加入不同含量溶菌酶，并研究氢氧化钠处理对负载溶菌酶的复合膜的溶菌酶活性及抑菌性能的影响。

1.材料：主要试剂

2.主要仪器设备

1.壳聚糖/纳米二氧化硅复合膜的制备

通过溶剂蒸发法制备壳聚糖/纳米二氧化硅复合膜，参照Liu的方法稍作修改。首先精确称取一定量壳聚糖加入1%（v/v）的醋酸溶液中，使壳聚糖浓度为2%（w/v）。

将其置于磁力搅拌水浴锅中，在40℃下加热搅拌4h，直至壳聚糖完全溶解，过滤去除不容物。再以0.5mL/g（参照壳聚糖质量）的浓度加入甘油，搅拌30min得到的壳聚糖溶液，待用。

取一定量纳米二氧化硅加入1%(v/v)的醋酸溶液中，使用磁力搅拌水浴锅在40℃下加热搅拌1h，再以0.5mL/g（纳米二氧化硅）的浓度加入甘油制备2%（w/v）的纳米二氧化硅溶胶。

分别将纳米二氧化硅溶胶按照占总成膜液0%，5%，10%，15%，20%，25%，30%的比例与壳聚糖溶液混合，40℃恒温磁力搅拌搅拌2h，然后经过真空脱气，再超声处理2h，使纳米二氧化硅在壳聚糖中充分分散，得到成膜溶液。随后将其倾倒在成膜模具上延流平整

膜溶液于50℃干燥成膜后，揭下并浸泡在5%（w/v）的NaOH溶液10min，随后用去离子水清洗干净，干燥后保存待用。

2.成膜溶液的流变行为测定

含有不同纳米二氧化硅浓度（0%、5%、10%、15%、20%、25%和30%）的成膜溶液的流变行为通过旋转平板流变仪进行测定，选取直径为40mm的平行板，间隙设定为1mm，在25℃下，以剪切速率在0.1-100s-1的范围内获取稳态流变曲线，并在应变为3%，频率在0.1-100rad/s的范围内获取动态流变曲线。

3.成膜溶液的低场核磁（LF-NMR）测定

利用低场核磁共振仪测定成膜溶液中壳聚糖和纳米二氧化硅与水分子的相互作用。

使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列在32℃恒温条件下进行测定。将样品加入到1.5cm直径的核磁进样管中。测定条件为：TW=4000ms，NECH=8000，NS=8，TE=0.5ms。

4.壳聚糖/纳米二氧化硅复合膜的红外光谱测定（FTIR）

采用Nexus470傅立叶变换红外光谱仪测定不同比例复合膜的红外谱图，扫描范围为4000-400cm-1。扫描环境为室温，扫描次数64次。

5.壳聚糖/纳米二氧化硅复合膜的X-射线衍射分析（XRD）

采用X-射线衍射仪(BrukeD8Advance)在衍射角2θ=5-50°的范围测定样品的衍射图谱。测定电压为40kV，连续步式扫描，测定步长为0.02°。

6.壳聚糖/纳米二氧化硅复合膜的热重分析（TG）

将膜烘干后裁剪成碎片，采用热重分析仪测试膜的热稳定性。测试条件：氮气流速为100ml/min，升温速率10℃/min，检测温度范围25-600℃。

7.壳聚糖/纳米二氧化硅复合膜的扫描电镜分析（SEM）

首先将样品烘干，随后将待测样品用导电粘胶固定在铜板支架上，在真空条件进行喷金处理，采用场发射扫描电子显微镜观察样品的微观形态并拍照记录。

8.壳聚糖/纳米二氧化硅复合膜的颜色和不透明度测定

依照CIELAB表色系统来表示颜色，采用色度仪测定膜的颜色，以白板作色差测定参比，每个处理最少测4次，分别计算膜的L*、a*、b*和ΔE值。

颜色指数是L=0（黑色）到L=100（白色），-b（蓝色）到 b（黄色），-a（绿色）到 a（红色）。

膜的不透明度（Opacity）以紫外分光光度计测定600nm的吸光度来表示。在膜上随机取5个点测量厚度，取平均值（精确到0.001mm），将膜裁剪成长条固定在比色皿的侧面上进行测定，每个样品至少测定3次。按照公式进行计算。

9.壳聚糖/纳米二氧化硅复合膜的机械性能测定

膜的力学性能包括抗拉强度和断裂延伸率等指标，膜的力学性能取决于成膜材料的分子量、溶剂和增塑剂的性质及含量等。

不同类型的大分子聚合物因为分子量和结构的不同，导致成膜内部结构及表观性质的不同。抗拉伸强度表征膜试样在测试方向上能承受的最大拉力。断裂延伸率即为膜拉断时长度的变化率。

将膜置于相对湿度为53％±5％的干燥箱中，于25℃环境中平衡48h。将膜裁成10mm×70mm的长条。膜的厚度在膜上随机取5个点，用数显螺旋测微仪（0.001mm）测量并取平均值。采用万能材料试验机测试膜的机械性能，上下夹具距离为25mm，拉伸速率设为100mm/min，每个试样测5次。

纳米二氧化硅对壳聚糖成膜溶液流变行为的影响

观察高分子材料膜溶液的流变行为，分析溶液的微观结构和相互作用，对成膜的加工过程和成膜后的性能具有指导意义。

从图可以看出，在低剪切速率区间，不同比例复合膜液的表观粘度随着纳米二氧化硅的添加量增加而减少，说明加入不同比例纳米二氧化硅后混合溶液仍然属于典型的假塑性流体。

大分子聚合物的粘度主要受到聚合物内部的自由体积和分子之间的缠结影响。自由体积是指分子链之间未被分子所占据的间隙，自由体积越大，分子运动就更容易。

当溶液受到外力发生流动时，壳聚糖分子随着流动方向运动且分子缠结打开，且未来得及恢复就遭到进一步的破坏，因此其表观粘度随着剪切速率增加而降低(Silvaweissetal2013，Wuetal2016)。

纳米二氧化硅的加入会减弱壳聚糖分子之间的相互作用，降低分子链之间的缠结效应，同时壳聚糖内部结构网络化程度降低也会增加自由体积，因此表现为随着纳米二氧化硅的添加，溶液在流动过程中受到的阻力就会减小，粘度逐渐下降。

值得注意的是，当纳米二氧化硅的浓度高于15%时，成膜溶液在剪切速率为1s−1时，表现出轻微的剪切增稠行为。

因为高分子聚合物在流场的作用下具有剪切变稀和剪切增稠两种行为相互竞争，当剪切变稀行为远远大于剪切增稠时，溶液体系对外表现为剪切变稀行为。

但是当剪切速率逐渐增大，分子解缠结作用增强，内部网络结构被破坏，分子间相互作用降低，体系粘度降低，当分子间缠结在流场作用下达到最低时，体系的剪切增稠作用就会表现出来，此时一些孤立的分子团聚体会再次产生聚集，分子间形成新的缠结，所以表观粘度出现轻微的增加(Chenetal2009)。

由此可以推断，当纳米二氧化硅浓度较高时，壳聚糖分子和纳米二氧化硅颗粒会产生物理相互作用(Chenetal2007，Songetal2016)。图反应了不反映品的剪切应力随着剪切速率的变化关系。当纳米二氧化硅含量增加时，成膜溶液的剪切应力也逐渐降低。

纯壳聚糖溶液的剪切应力最大表明其溶液中的分子间缠结最多。

流变研究中储存模量G’对应的是材料中存储的能量，损耗模量G’’反应了动态振荡中损失的能量，可以用来研究聚合物分子间相互作用。

如图所示，不同纳米二氧化硅含量的成膜溶液的G’流变曲线在低频率区（小于1Hz）有明显的差异，但是在高频区间各样品的G’越来越接近。与未加入纳米二氧化硅的纯壳聚糖溶液相比，含有5%和10%纳米二氧化硅溶液的G’和G’’明显较小。

然而含量高于15%时G’随着二氧化硅含量的增加而变大，当二氧化硅含量25%时溶液达到G’值最大。30%的纳米二氧化硅反而使成膜溶液的G’发生下降，说明其分子排列不整齐，粘弹性较差。

当二氧化硅含量为20%和25%时，溶液的G’值高于G’’值，说明其主要的施加能量被储存在材料内部，使材料的粘弹性行为更接近弹性固体。这些结果表明纳米二氧化硅含量为20%和25%时，成膜溶液内分子间缠结形成丰富的网络结构，阻止了分子间的相互运动(Xiaoetal2012)。